Determinació de la concentració de proteïna pel mètode de Biuret
10:41:00
OBJECTIU
Conèixer els mètodes qualitatius i quantitatius per determinar la presència de proteïna en una mostra.
En aquesta pràctica determinarem la quantitat de proteïna present en les 4 fraccions procedents de la purificació feta en la pràctica de cromatolografia de gel filtració. També calcularem el rendiment de la columna emprada.
FONAMENT
Les substàncies que contenen dos més enllaços peptídics formen un complex de color púrpura amb les sals de coure en solució alcalina. La substància que dóna nom a la reacció, el biuret, és un dímer de la urea format amb pèrdua d'una molècula d'amoníac.
2NH 2 – CO-NH2 → NH2 – CO – NH – CO – NH2 + NH3
La coloració que apareix és degut a la formació de complexos cúprics de coordinació i és proporcional a la quantitat de proteïna present a la mostra.
PROCEDIMENT
Per tal de realitzar la recta de calibratge, prepareu un tub blanc i 5 tubs patró segons els que ens indica la següent taula:
Retoleu 4 tubs més (V0,
V1, V2 i V3) en els quals afegirem 1 ml de cadascun dels tubs eluïts de la columna de Sephadex, per tal de preparar els tubs problema.
Un cop tingueu preparats tots els tubs (blanc, patrons i problemes) afegiu a cadascun d'ells 4 ml del reactiu Biuret.
Agiteu bé i deixeu reposar a temperatura ambient durant 30 minuts.
Passat aquest temps llegiu l'absorbància a 550 nm.
Font: Obradors, N. (2014). Dossier de Pràctiques: Grau de Nutrició Humana i Dietètica. Manuscrit inèdit.
0 comments