OBJECTIU
Conèixer els fonaments bàsics de les tècniques cromatogràfiques: que són, per a què serveixen i quin tipus de cromatografies existeixen. En aquesta pràctica ens centrarem en la cromatografia de gel filtració i aprendrem a separar una proteïna de les sals que l'acompanyen.
Conèixer els fonaments bàsics de les tècniques cromatogràfiques: que són, per a què serveixen i quin tipus de cromatografies existeixen. En aquesta pràctica ens centrarem en la cromatografia de gel filtració i aprendrem a separar una proteïna de les sals que l'acompanyen.
FONAMENT
Les tècniques cromatogràfiques s'utilitzen per separar molècules partint de la base de les seves diferències en grandària, forma, massa, càrrega, solubilitat i propietats d'adsorció. Hi ha molts tipus diferents de cromatografia, però tots ells impliquen interaccions entre tres components: la mescla de molècules que s'han de separar, una fase sòlida (fixa) i una fase mòbil (el solvent).
Les tècniques cromatogràfiques s'utilitzen per separar molècules partint de la base de les seves diferències en grandària, forma, massa, càrrega, solubilitat i propietats d'adsorció. Hi ha molts tipus diferents de cromatografia, però tots ells impliquen interaccions entre tres components: la mescla de molècules que s'han de separar, una fase sòlida (fixa) i una fase mòbil (el solvent).
La cromatografia del gel filtració és una tècnica que permet separar molècules de diferents grandària. Consisteix en fer passar aquestes molècules a través d'una columna que contingui partícules inflades d'un polímer que tenen una mida de porus determinat (fase sòlida). Les molècules petites (de mida inferior al porus) poden penetrar dins de les partícules de gel mentre que les grans no. Això fa que les molècules petites, que difonen dins del gel triguin més a ser eluïdes, metre que les grans, que no poden penetrar abandonen la columna abans, ja que disposen de menys volum de solvent (fase mòbil). D'aquesta manera és possible separar molècules que difereixen en mida.
El volum total d'una columna de gel filtració, Vt, és la suma del volum de solució aquosa dins de les partícules del gel, Vi, i del volum de solució aquosa fora de les partícules del gel, Vo, anomenat també volum buit.
Vt = Vi + Vo
Aquesta tècnica té un ampli ús en bioquímica. Es pot utilitzar en diferents processos com ara: purificació de proteïnes, dessalat de proteïnes, determinació de pesos moleculars i com a criteri de puresa d'algunes substàncies d'origen biològic. Existeixen diferents tipus de gel, que tenen diferent mida de porus. En funció de la mida de les molècules que ens interessi separar en triarem un o altre.
PROCEDIMENT:
Preparació del gel de Sephadex G-25 i empaquetament en una columna
En primer lloc cal pesar el Sephadex necessari i hidratar-lo en aigua o en tampó durant tota la nit a temperatura ambient. Un cop el gel estigui hidratat es pot procedir al seu empaquetament en una columna.
Per muntar la columna, primer cal introduir una petita bola de llana de vidre per evitar que s'escapi el gel hidratat. Després heu d'introduir la suspensió hidratada de Sephadex G-25, amb l'ajut d'una pipeta Pasteur, dins de la columna fins arribar a tenir una alçada de gel sedimentat d'aproximadament 3/4 de l'alçada total de la columna. Cal evitar que la columna s'assequi. Un cop muntada, cal rentar-la amb dos volums de tampó fosfats, tancar la clau de la sortida del tampó i tapar amb Parafilm la part superior, tenint cura de deixar prou nivell de tampó a la part superior de la columna per tal que no s'assequi.
Calibratge de la columna
Per tal de poder fer la separació cromatogràfica cal en primer lloc calibrar la columna, és a dir, conèixer els diferents volums on elueixen les molècules que tenen mides diferents.
Per calibrar la columna utilitzarem una barreja de dos colorants que tenen diferent massa molecular i que un d'ells té una mida superior al límit d'exclusió i l'altre la té inferior. Per tant, es comportaran de forma diferent.
Els colorants utilitzats són:
blau dextrà PM = 2.000.000
dicromat potàssic PM = 294
En la pràctica, pel calibratge col·locarem a la part superior de a columna de Sephadex 0,5 ml de la barreja dels dos colorants, que presenta un color verd intens per la superposició del blau del dextrà i el groc del dicromat. A continuació cal deixar penetrar la solució dins de la columna i després anar afegint contínuament aigua o solució fosfats fins que aconseguiu l'elució completa dels dos compostos, que s'ha de produir en bandes separades. Finalment heu de rentar la columna amb un volum igual a 2 vegades el volum del llit..
El comportament dels dos colorants ens permetrà calcular:
a) Volum del llit (Vo) o volum d'aigua dels espais interpartícules. Aquest volum correspon als ml d'aigua recollits abans de començar a eluir el blau dextrà.
b) Volum d'elució del colorant blau de dextrà o Volum d'exclusió del gel. Correspon als ml de colorant blau recollits (V1)
c) Volum que queda entre els dos colorants i que correspon al volum d'elució del gel pròpiament, on es separen per mida les molècules que tinguin una massa compresa entre els dos límits d'exclusió (V2).
d) Volum d'elució del dicromat, que correspon als ml de dicromat recollits (V3). En aquest volum sortiran totes aquelles molècules que siguin més petites que el límit d'exclusió baix.
Un cop tenim anotats tots els volums, podem passar a aplicar la solució problema que conté les sals i les proteïnes que volem separar.
Aplicació de la mostra i separació
Apliqueu 0,5 ml de solució problema tal i com ho heu fet en la calibratge. Aquesta solució és una barreja d'una o més proteïnes i sals inorgàniques i conté la proteïna que ens interessa purificar, l'albúmina sèrica bovina (PM = 66.000 Da),
Recolliu les 4 fraccions, segons les dades obtingudes en el calibratge de la columna Vo, V1, V2 i V3, en quatre tubs diferents que guardareu tapats amb Parafilm i ben reolats.
Finalment, renteu la columna amb un volum d'aigua igual a 2 vegades el volum del llit (Vo).
Font: Obradors, N. (2014). Dossier de Pràctiques: Grau de Nutrició Humana i Dietètica. Manuscrit inèdit.
