Determinació de la constant de Michaelis-Menten (Km) de l'α-amilasa peral midó
10:19:00
Abans d'explicar aquesta pràctica els recomano veure el post anterior sobre la cinètica enzimàtica i la pràctica sobre l'estudi de les característiques enzimàtiques de l'enzim α-amilasa.
FONAMENT
En aquesta pràctica es mesura l'efecte de diferents concentracions de substrat sobre la velocitat de reacció. En aquest cas es treballa amb dos paràmetres constants com són el temps d'actuació de l'enzim i la quantitat d'enzim, i es varia la concentració del substrat, el midó.
El valor de la Km es extrapolar gràficament a partir de l'efecte de la concentració de substrat sobre la velocitat de reacció, segons les representacions gràfiques de Michaelis-Menten (V enfront de S), Lineweaver i Burk (1/V enfront 1/S) o Eadie-Hofstee (V enfront de V/S). El valor de Km és independent de la concentració d'enzim.
La representació dels dobles inversos
A continuació es mostra una típica representació de V en front de [S] per un enzim que segeuix una cinètica Michaelis-Menten. Com es pot observar, a partir d'aquesta representació ni el valor de Vmax ni el Km són evidents d'una forma clara.
Per a obtenir Vmax i Km a partir d'aquestes dades és més habitual fer la representació dels dobles inversos (Lineweaver-Burk), on l'equació de Michaelis-Menten s'ha transformat de manera que ara es pot representar 1/V en enfront de 1/[S]
Aquesta transformació de l'equació de Michaelis-Menten ha donat lloc a l'equació d'una recta, a partir de la qual es pot observar fàcilment els valors de Vmax i Km.
PROCEDIMENT
Es numeren 6 tubs (petits) i es preparen les següents dilucions amb tampó fosfat a partir de la solució de midó a l'1%.
Numereu una altra sèrie de tubs (llargs) i addicioneu a cada tub 0.5 ml de cadascuna de les dilucions preparades abans.
Paral·lelament prepareu un tub blanc (B) amb 0.5 ml de tampó fosfats. Afegiu-hi 1 ml de 3,5-DNS, agiteu i a continuació 0.5 ml de la solució α-amilasa.
Deixeu els 6 tubs durant 5 minuts a 20ºC (damunt la taula).
Afegiu a cadascun dels 6 tubs llargs 0.5 ml de solució d'α-amilasa a intervals de 30 segons.
Als 3 minuts exactes d'haver afegit la solució d'α-amilasa al primer tub, afegiu 1 ml de 3,5-DNS a cadascun dels tubs mantenint també els intervals de 30 segons. D'aquesta manera tots els tubs l'enzim i el substrat hauran estat en contacte exactament 3 minuts.
Col·loqueu tots els tubs, inclòs el blanc, en una banyera a 100ºC durant 5 minuts.
Refredeu els tubs i afegiu-hi 8 ml d'aigua destil·lada a cadascun d'ells.
Un cop ben agitats i homogenis, llegiu l'absorbància a 540 nm enfront del blanc.
.JPG)
.JPG)
.JPG)
.JPG)
Font: Obradors, N. (2014). Dossier de Pràctiques: Grau de Nutrició Humana i Dietètica. Manuscrit inèdit.
0 comments