Abans d'explicar aquesta pràctica els recomano veure el post anterior sobre la cinètica enzimàtica.

OBJECTIU

En aquesta pràctica determinarem el rang de linealitat de la reacció enzimàtica en les condicions de treball que considerem òptims, és a dir, en quin marge de temps s'està treballant a velocitats inicials i no hi ha problemes de pèrdua d'activitat. Per això realitzareu una cinètica de temps on l'únic paràmetre serà el temps, tant la concentració de substrat com la de l'enzim seran concentrats, l'únic que variarà serà el temps d'actuació de l'enzim. 

FONAMENT

L'α-amilasa és un enzim hidrolític de polisacàrids de reserva, tant animals (glucogen) com vegetals (midó). Tots dos polímers estan formats per molècules de α-D-glucosa unides per enllaços α (1 → 4), que formen llargues cadenes de les quals surten ramificacions per enllaços de glucosa de tipus α (1 → 6). L'α-amilasa trenca específicament els enllaços α (1 → 4) entre glucoses generant com a producte glucosa, maltosa i dextrines. Aquests productes generats són sucres amb poder reductor, característiques que s'utilitza per quantificar l'activitat de l'enzim.

El mètode utilitzat per a la determinació de l'activitat α-amilasa es base en l'augment del poder reductor que experimenta una solució de midó a pH 6.9 i a 20ºC com a conseqüència de la seva hidròlisi per part de l'enzim. Aquest augment pot posar-se de manifest fent reaccionar els productes de la hidròlisi amb l'àcid 3,5-dinitrosalicílic (3,5-DNS) de manera que s'obté un producte amb una coloració característica. Aquesta coloració és directament proporcional a la quantitat de sucres reductors presents. 

PROCEDIMENT

Numereu 7 tubs llargs (1-7) i un altre tub llarg per al blanc. 

Afegiu a casacun dels tubs 035 ml d'aigua d'una solució de midó a l'1%. Si la solució està freda deixeu els tubs 5 minuts a temperatura ambient. 

Afegiu 1 ml de 3,5-DNS al tub blanc, agiteu bé i afegiu 0.5 ml de la solució d'enzim.

A la resta de tubs numerats, controlant exactament el temps, afegiu a cadascun d'ells 0,5 ml de la solució d'enzim, tal i com s'indica en l'esquema d'operacions. Cada vegada que afegiu l'enzim cal agitar. 

Seguint el mateix esquema afegiu als tubs 1 ml de 3,5-DNS i agiteu cada vegada. En el moment en què afegiu aquest reactiu s'atura la reacció enzimàtica perquè es denaturalitza l'enzim.